Ученым из Университета Калифорнии (Сан-Диего) удалось создать исключительно эффективный метод внесения мутаций сразу в две гомологичные копии генов на двух хромосомах.

Метод основан на системе бактериального иммунитета CRISPR/Cas9 и достигает эффективности в 97 процентов в мушек, напоминающих альбиносов. Таким образом, новый метод под названием Мутационная Цепная Реакция (MCR), позволяет конвертировать гетерозиготные мутации – в гомозиготные. Работа опубликована в Science, ей также посвящена редакционная статья журнала.

CRISPR/Cas9 – самая новая и надежная система, позволяющая редактировать геном эукариот. Она состоит из специального белка-нуклеазы (Cas9) и «кассет» РНК, которые направляют его активность на те или иные последовательности ДНК. В природе CRISPR/Cas9 выполняет роль "иммунной системы" бактерий, защищая их от вторгающихся вирусов. Если бактерии удается выжить после заражения, она «режет» вирусную ДНК и встраивает ее кусочки в собственный геном – в эти самые «кассеты» – а позже использует их как фоторобот преступника. Когда вновь попавшая в клетку ДНК вируса опознается «кассетой», тут же активируется Cas9 – белок, разрезающий чужеродную ДНК. По механизму работы эта система напоминает открытую значительно ранее РНК-интереференцию у эукариот.

Три года назад элементы системы CRISPR/Cas9 начали использовать в генной инженерии. Чтобы осуществить трансгенез, нужно синтезировать комплементарный направляющую РНК (guide-RNA) к той последовательности на хромосоме, которую требуется изменить, а также включить в конструкцию белок Cas9. При попадании в ядро РНК-проводник находит требуемую последовательность в хромосоме и точно указывает белку-нуклеазе, где ее разрезать. Затем в ДНК клетки-хозяина встраивается чужеродный ген или последовательность, нарушающая функцию данного гена (loss-of-function mutation).

Схема метода: генетическая конструкция, которую инъецируют в клетки, состоит из 1) разрезающего белка Cas9 2) направляющей РНК и 3) гомологичных плечей, благодаря которым после внесение разрыва гомологичная репарация приводит к встраиванию конструкции в геном. A,B,C — встраивание в первую гомологичную хромосому D,E,F — встраивание во вторую копию.
В ранних версиях использования CRISPR/Cas9 удавалось внести изменения только в одну из гомологичных хромосом. В случае рецессивного наследования (то есть когда одной рабочей копии гена достаточно) такие особи хоть и несли одну мутацию, но не проявляли ее — в их геноме сохранялась нормальная, «работающая» копия гена. Чтобы получить животных с проявлением мутации ученым приходилось проводить серию скрещиваний — получать рецессивных гомозигот по мутантному гену.

Ганц и Биер создали конструкцию, которая встраивает в одну из хромосом мушки две последовательности: ген, кодирующий белок Cas9 и направляющую РНК, комплементарную второй хромосоме. Далее реакция протекает автокаталитически: со встроенной последовательности считывается конструкция-«близнец», инициирующая разрезание гена уже на соседней, гомологичной хромосоме. Клетка сама синтезирует конструкцию, разрезающую вторую хромосому в нужном месте, а затем достраивает, «ремонтирует» разрыв, внесенный белком Cas9 («ремонт» основан на природной системе исправления ошибок — гомологичной репарации, — которая существует во всех клетках). В случае с мухами вставка прерывала ген, ответственный за желтую окраску тела, в результате чего мухи, несущие мутацию на каждой из гомологичных хромосом, становились практически бесцветными.

Ученые провели ключевой эксперимент, чтобы выяснить, передается ли мутация, внесенная в женскую X-хромосому, следующим поколениям. Оказалось, что метод отлично работает и на соматических, и на половых клетках D. melanogaster: при скрещивании 97 процентов потомства было «альбиносами».

Эффективность метода уже вызвала большие опасения у некоторых ученых: такая мутация, попав на свободу, может в ураганных темпах распространяться в популяции. Гарвардский ученый Джордж Чёрч, тоже работающий с CRISPR/Cas9, считает, что подобные исследования вовсе нельзя публиковать, так как они не включают защитных мер, предотвращающих попадание мутантов за пределы лаборатории, а протокол выполнения эксперимента достаточно прост, чтобы им могли воспользоваться не только ответственные ученые.

Но именно тот факт, что отредактированные гены способны распространяться столь быстро, делает метод уникальным. Этан Биер в сотрудничестве с Энтони Джеймсом (Калифорнийский Университет в Ирвине) собирается создать мутантных москитов, гены которых будут обеспечивать устойчивость к заражению малярией и лихорадкой Денге. По подсчетам ученых, гены быстро распространятся в популяции, комары попросту не смогут заражать человека, и малярия исчезнет.



СМОТРЕТЬ КОММЕНТАРИИКомментариев нет

Последнее: 6-этажный «долгострой» в Кувшиново еще недавно считался самой главной проблемой строительной сферы области. Более сотни его будущих жильцов оказались обманутыми. Об этом сообщил газете ВЗГЛЯД глава Вологодского района Сергей Жестянников. Благодаря вмешательству губернатора Олега Кувшинникова, отмечает глава района, с проблемой удалось справиться. Шестиэтажный кирпичный дом в поселке Кувшиново Вологодского района Вологодской области достроен. Этого события […]

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ:

новости дня
ваши отзывы